出品丨虎嗅医疗组

作者丨苏北佛楼蜜

题图丨Unplash


2012年8月17日，詹妮弗·杜德娜（Jennifer Doudna）和埃玛纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanulle Charpentier）合作，在Science 杂志发表了基因编辑史上的里程碑论文，成功解析了CRISPR/Cas9基因编辑的工作原理。

 

华裔科学家张锋随后在Science杂志发表论文，首次将CRISPR/Cas9基因编辑技术改进并应用于哺乳动物和人类细胞。自此，近年来生命科学领域最耀眼的技术正式宣告诞生。三人的命运也因一项技术的出现而彼此交织，聚焦在诺贝尔奖的角逐上，但最终以张锋与诺奖是失之交臂而短暂告终。

 

8月31日，张锋在Nature Biotechnology发表了围绕基因编辑工具CRISPR/Cas13系统的最新研究。这项研究声称开发了目前最小的CRISPR/Cas13系统，可以更好地在体内进行RNA编辑，来治疗各种疾病，这一研究会给基因编辑带来哪些改变？我们离基因编辑又进一步了吗？


编辑RNA


CRISPR是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，充当了防御外源遗传物质的“基因武器”，全称为Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats，翻译为“成簇的规律间隔的短回文重复序列”，分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。

 

其中，CRISPR序列由众多短而保守的重复序列区（repeat）和间隔区（spacer）组成。重复序列区含有回文序列，可以形成发卡结构。而间隔区比较特殊，它们是被细菌俘获的外源DNA序列。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。


 

CRISPR位点结构图

 

而在上游的前导区（leader）被认为是CRISPR序列的启动子，上游区域还有一个多态性的家族基因，这些基因编码的蛋白可以和CRISPR序列区域共同发生作用，他们被命名为CRISPR关联基因（CRISPR associated），缩写为Cas。目前已经发现了Cas1-Cas13等多种类型的Cas基因。

 

Cas基因与CRISPR序列共同进化，形成了在细菌中高度保守的CRISPR/Cas系统，这是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，例如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的二次免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。

 

CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰（RNAi)的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具，张锋就是研发这一工具的先驱之一。

 

在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。现在，在实验室里，人们就可以使用CRISPR/Cas9技术轻松地实现基因编辑，但这一系统通常被用于编辑DNA，对于人体内另一种重要的遗传物质RNA则稍显疲软。

 

另一种蛋白Cas13则可以很好作用于RNA的蛋白，它被地应用于RNA表达敲低、RNA单碱基编辑和RNA定点修饰、RNA活细胞示踪以及核酸检测领域。相比于传统的RNA干扰技术，Cas13系统具有更高的敲低效率和特异性。

 

最重要的是，相比于Cas9介导的DNA编辑技术，Cas13蛋白不会对基因组造成永久性改变，甚至可以通过药物来调控RNA编辑，使其具有可逆性，因此在疾病治疗上具有比较独特的优势。张锋在研究中强调，他们找到了最小的Cas13蛋白，并将其命名为Cas13bt，它的大小只有其他Cas13蛋白的一半，因为小所以递送更加方便。


不会完全取代RNAi技术


张锋的研究就围绕这一系统，但他并非首个研发出CRSPR/Cas13的科学家。早在今年5月，中科院脑智中心（中科院神经所）的科学家杨辉及其团队在Nature Methods也发表了相关的研究论文。

 

该研究称，通过对微生物大规模宏基因组数据进行计算分析发现两类新的CRISPR/Cas13系统，可以用作开发RNA编辑的基因治疗手段，效果同样类似于RNAi，阻断相应基因表达的转录过程，让基因沉默。

 

杨辉团队的博士后及参与研究的研究人员之一周英思告诉虎嗅，与张锋的研究相比，二者的Cas13蛋白序列上存在很大的重叠，不同点在于双方的实验体系的不同，从而采用了不同的研究策略，例如张锋老师的文章都很少涉及流式细胞实验，而杨辉老师的文章则很少涉及生化和原核细胞实验。

 

由于作用效果与RNAi技术相似且沉默效率更好，双方的研究是否会对RNAi的市场产生冲击？周英思持否定的态度。

 

他认为，RNAi具备先发优势，整个领域经历了20多年积淀已经非常成熟了，而且已经有几款疗法成功上市。Cas13相比于Cas9都显得很年轻，它在效率，保真性上比RNAi更有优势，另外在体内更容易实现组织特异性和条件特异性的RNA敲低，但其安全性仍需要经历长期谨慎的评估。当然，目前小型Cas13可以高效地编辑绝大部分位点，可能会在未来大大降低RNA干扰药物研发以及新靶点研究的成本。

 

相比于取代RNAi，他认为CRISPR/Cas13在RNA单碱基编辑方面具有更独特的价值，例如它通过单个AAV递送就能精准高效地修复体内某些致病突变，同时他们也发现截短型Cas13比任何已知的RNA结合蛋白都具有更好的特异性。过去的CRISPR多停留在DNA编辑工具，科学家对RNA的关注热度不高，而先驱之一张锋的研究也进一步说明，基因编辑工具的研究热点正在向RNA偏移。未来，更多疾病的治疗都将起始于这些零星崭新改变。


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