文/张洪涛 宾夕法尼亚大学医学院 副教授核心提要
1. 新冠病毒突变导致部分核酸检测试剂盒失效，国内外多地出现“多次检测阴性后转阳”现象。为提高病毒检出率，中国推出肛拭子检测项目，部分欧美国家近日开始效仿。
2. 肛拭子检测并不一定比鼻咽拭子更为灵敏，尤其可能不适用于筛查早期感染者。其原因可能是，病毒聚集的部位随着病毒感染进程的变化而发生改变。
3. 尽管粪便检测是优先选项，但相比粪便标本，肛拭子采集具有不易造假的优点。
4. 针对病毒突变可能给核酸检测带来的影响，有关部门应加强对检测试剂盒生产者的监督，增加三靶标的试剂盒，以及对已经隔离14天的人员进行IgM检测而非肛拭子检测。
病毒突变致多种核酸检测试剂失效，肛拭子检测新冠病毒继国内推广使用后，似乎正在成为国际通用做法？2月1日，西班牙也开始在加西亚省将肛筛用于检测新冠肺炎。而相关资讯表明，欧美有部分医院在对部分重症病人的相关测试中，增加了粪便检测。日前，网传“石家庄市民进过肛拭子核酸检测后秒变企鹅，走路姿势变成了外八字“，相关的视频随即被披露是谣言，但是国内确实对一些重点隔离的人群开始进行肛拭子检测。上述国家增加肛拭子检测，据称是因应病毒突变导致的核酸检测试剂盒失效。而南非、英国病毒突变后，在世界各地包括国内，也相继出现了检测十次以后转阳的病例。印度报道了一例自去年5月首诊确诊后，经治疗症状消失后，5个月内做了17次PCR检测、14次快筛检测共31次，仍然阳性，至今仍在隔离。1月15日，石家庄也出现了一例检测10次才转阳的病例。美国FDA日前警示，认为病毒突变已经致部分试剂失效，并列举了几个可能会受到突变影响的试剂盒。这意味着，病毒突变可能已导致部分核酸检测失效或者出现持久假阴性。这背后的原因是什么？肛拭子真能解决问题吗？到底应该如何应对？有没有比肛拭子更好的办法？
隔离中密切接触者多次检测阴性后转阳，核酸检测灵敏度有问题新冠确诊病例在全球已经突破1亿人。在中国，疫情在入冬之后也有死灰复燃的情况，为了保障春运、春节的安全，很多地方加大了病毒检测的力度，而肛拭子检测，是如今在一些地方新增加的检测项目。
增加肛拭子检测，目的是为了增加病毒的检出率。如果要说核酸检测，中国应该是世界上最强的国家，没有之一，之前已经在武汉、青岛、喀什等地方都做了全员检测，因为及时的检测，从武汉到之后各地零星出现的疫情，都被及时扑灭，按理说中国应该非常有经验、非常有信心对待出现的疫情。是什么情况导致了肛拭子检测的出现呢？这跟多地出现的“多次检测阴性后转阳”的感染者有关。在12月26日，顺义出现了疫情，流调溯源到的“零号感染者”，于2020年11月26日从印尼入境福建，同机同排座位旅客在入境后确诊。但是，这名男子在福建按照规定隔离14天期后，核酸检测结果为阴性，解除隔离后于12月10日到北京顺义区居住地。在当地发现疫情后，该男子只是血清IgM抗体阳性，新冠病毒核酸检测结果仍为阴性，此时他离密切接触同机感染病例的时间已经30天。在第32天时，核酸检测才出现阳性，被诊断为无症状感染者。
在1月24日，河北省卫健委公布了头一天确诊的17个病例，其中的病例15是藁城区居民，1月2日至1月9日居村无外出，期间3日、4日、5日、8日4次核酸检测均为阴性；1月10日转运至藁城区指定隔离点进行集中隔离医学观察，当日核酸检测呈阴性；1月11日因发热转运至晋州市人民医院发热门诊，直至1月21日均在发热门诊隔离病房进行治疗，期间8次核酸检测均为阴性；在1月22日，核酸检测才出现阳性。根据第一财经的报道，在石家庄的核酸筛查中，这种“多次核酸检测为阴性，最后才确诊阳性的病例” 并不少见。在石家庄市1月15日~21日确诊的222例病例中，有190人进行两次以上核酸检测才确诊，最多的是1月20日确诊的一个病例，进行了10次核酸检测，从1月3日持续到1月20日，前后达17天。因为有这些多次检测都是阴性的病例，要尽快在第一时间检出感染者，就需要一种检出率更高的方法。肛拭子检测于是粉墨登场了。
图/国外发布的关于自己采集肛拭子标本的示意图
肛拭子检测核酸，是否比咽拭子更灵敏？患者出院的双检测可能较合理，早期感染的筛查，是否有效，值得商榷肛拭子检测新冠病毒，并不是2021年的新事物。去年5月13日发表的一份综述性研究，专门整理了肛拭子及粪便中进行的新冠病毒核酸检测结果，总共找到12份已经发表的研究，全都来自中国。在这12个研究里，总共有324个新冠患者，其中107名患者在鼻咽拭子样本核酸转阴之后，肛拭子或粪便检测仍然显示阳性，持续时间为5 －35天 (1)。鼻咽拭子都转阴了，肛拭子还阳性，这似乎可以理解为肛拭子检测更灵敏。但是事情并没有那么简单，因为对患者同时进行的检测发现，也有这样一些患者，鼻咽拭子结果是阳性的，但肛拭子或粪便的结果却是阴性 (2, 3)。有一种说法认为，随着病毒的感染进程变化，病毒富集的部位会有不同，一开始主要是在鼻咽、呼吸道，最后会迁移到肠道、肛门。如果这个说法是对的，那么肛拭子和粪便的检测，对于决定患者是否完全转阴、是否能出院，是比较合理的，至少可以把它当作一个双保险，如果患者鼻咽拭子、肛拭子都是阴性了，那说明体内病毒清除得比较彻底，可以放心出院了，也不用担心排毒感染其他人。但是用来作为早期感染的筛查，就不太合适了。
图/《中华检验医学杂志》
在2020年7月发表的一篇《七种国产新型冠状病毒核酸检测试剂盒的一致性和检出能力评价研究》中，提出“部分试剂盒对弱阳性标本的检出能力欠佳，建议弱阳性标本应至少采取两个厂家的试剂盒复核检验，以保障结果的准确性。”
图/深圳华大基因试剂盒。核酸试剂在国内已成为一个较大的产业，据不完全统计，目前共有上百种核酸试剂盒，产值已在数百亿。
如果非要检测肛拭子或粪便，是否非要采菊？肛拭子不易作假，如果用粪便检测，会出现作假可能根据中国疾控中心网站上公布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》，对于粪便标本/肛拭子的表述是：“留取粪便标本约10克（花生大小），如果不便于留取便标本，可采集肛拭子。”可见，粪便标本是优先考虑的，只有在没有粪便标本的情况下，才进行肛拭子采集。已有研究表明粪便中可以培养出活的病毒(2)，但是并没有证据表明肛拭子比粪便更容易检出病毒。在之前进行肛拭子检测的研究中，很多患者是儿童，有的还不到1岁。想让这些患者提供粪便，似乎不太容易，不如直接用棉花签采菊，获得肛拭子样本。可是现在进行肛拭子检测的，大部分都是成人，为什么不能采集粪便，必须要使用伤害性不大，但羞辱性极强的肛拭子呢？在没有看到官方的解释解释之前，这里只能提供一个猜测：肛拭子不容易作假！如果让被检测者提供粪便，他们会不会随便借个粪便来蒙混过关呢？如果检测肛拭子，需要人员亲自将棉花签插入肛门，从保证样品的真实性来说，总比亲自监督被检测者提供粪便更容易。之所以想到这个原因，是看到某个提供核酸检测的地方，说可以在鼻咽拭子取样时同时拍照，作为申请绿码的证据。如果疫情更严重了，也许以后申请绿码需要肛拭子取样，不知道会不会需要拍照为证呢？
核酸检测“多次阴性”失效，真正原因可能是病毒突变了
从上面的分析其实可以看出，肛拭子检测并不见得比鼻咽拭子更灵敏，尤其可能根本不适用于尚只是处于早期的感染者。更关键的是，如果病毒出现了突变，原有的检测方法会受到影响，如果不改变方法，只是加大检测力度，很难获得理想的效果。大家可能听说了，病毒突变之后，可能会对疫苗的效果产生影响。目前已经有数据表明，南非变异体能让一些疫苗的保护率有所降低。那么，病毒突变导致检测失败的可能性存在吗？肯定的！这已经有先例了。英国出现病毒变异株B1.1.7， 在病毒的S基因处有数个突变，而S基因也是目前很多核酸检测所针对的区域。对此，世界卫生组织就已经发出公告警示，表明B1.1.7变异株S基因69/70位置的缺失突变，会影响现有的核酸检测。
美国FDA也对此做出了警示。在FDA的“温馨提示”信件中，还具体列举了几个可能会受到突变影响的试剂盒：Accula SARS-Cov-2 检测 （Mesa Biotech)：如果病毒在第28881个碱基处发生突变 (GGG to AAC)，该试剂盒检测会受到影响；TaqPath COVID-19 Combo 试剂盒（Thermo Fisher Scientific）：该试剂盒同时检测三个基因，英国出现的变异体B.1.1.7会影响其中一个检测结果；Linea COVID-19检测（Applied DNA Sciences）: 该试剂盒同时检测两个基因，英国出现的变异体B.1.1.7会影响其中一个检测结果；做核酸检测的美国公司Helix也注意到了病毒突变对检测的影响(4)。该公司的核酸检测同时测3个新冠病毒的基因：ORF1ab, N，和 S基因，因为英国出现的B.1.1.7.毒株在S基因上有缺失突变，检测中能检出ORF1ab和N，但是检不出S基因(4)。这个现象，叫做“S基因退群”。正是因为有这个“S基因退群”现象，目前类似Helix公司的核酸检测，也可以初步用来判断样本中的病毒是否是B.1.1.7.毒株。
图/上海一家生物企业生产的试剂盒
图/上海一家PCR实验室中的PCR检测仪
因为病毒突变，导致河北的检测多次出现阴性的可能性有多大？
根据第一财经的调查报告，在前面提到的石家庄市病例15的检测过程中，在1月18日以前，核酸检测结果都为阴性。但是，因为患者已经出现了临床症状，医院在18日使用了多种核酸诊断试剂进行检验。使用医院之前采购的某企业A核酸诊断试剂，核酸检测结果还是阴性，送到中医院进行检测，结果依然是阴性。但是如果换用S企业的核酸检测方法，结果就是阳性！1月22日，再次同时使用了A企业和S企业的两种不同检测方法，结果仍然是A企业的检测为阴性，S企业的的阳性。很显然，这两种检测结果之中，必须有一个是正确的。因为当天也进行了新冠病毒的抗体检测，结果为阳性，所以S企业的检测结果是准确的。在核酸检测中，对于每一个靶标，需要有两个引物序列和一个探针序列。如果病毒在这些引物或者探针的序列处发生突变，就会影响检测的效率。在中国疾控中心发布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》中（下面简称《技术指南》），新冠病毒核酸检测的两个靶标分别为ORF1ab 基因和N基因。
目前在河北流行的病毒株，会不会正好在这些关键的部位出现突变呢？1月6日，《中国疾病控制预防中心周报》公布了石家庄和邢台两例新冠病毒感染的病毒基因测序分析结果 (5)。根据所公布结果，这次河北藁城流行的毒株，与近期国内其它地方疫情中发现的毒株不同，与去年7月份在俄罗斯报道的毒株同源，属于B.1.1.123毒株。很巧的是，这种毒株的病毒基因上第28881～28883位碱基处正好发生了突变，而这里正好是N基因的正向引物的位置！是否A企业的双靶标试剂盒使用的引物正好与《技术指南》相符，导致检测结果受到基因突变影响？而S企业的试剂盒正好完美地躲过了这个突变？这需要有关方面来揭开谜底。
图/成都一家公司的核酸检测试剂盒
面对病毒，我们不能只是“脱裤子”，还得动脑子针对病毒突变可能给核酸检测带来的影响，为了更加有效地检出病毒，在此谨提出几条建议，供有关部门参考。1. 所有生产核酸检测试剂盒的公司，应该及时提供信息，表明试剂盒的检测结果是否会受目前已经出现的病毒影响。厂家不需要获得病毒株，可以根据网上公布的病毒突变序列，就可以设计病毒的核酸模版来来验证。2. 为了避免假阳性和假阴性，可以增加三靶标的检测试剂盒。在《技术指南》第二版中，确实提到需要“同一份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1ab、N）特异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性”，才能确认一个病例为阳性。这样要求，是为了减少假阳性，但是却会增加假阴性。在后来的《技术指南》版本中，已经对此修改，如果重新采样，重新检测后仍为单靶标阳性，则可判定为阳性。
图/目前《技术指南》判断阳性病例的标准
这样一个规定，虽然可以减少假阴性，但也可能把其他同源的冠状病毒误检为新冠病毒，所以应该使用三靶标，即便其中一个靶标处发生了突变，至少还有其他两个靶标的结果。当然，病毒也可能同时在两个以上的靶标处同时突变，但是发生这样突变的概率非常小。3. 对于已经隔离14天的人员，进行IgM检测，比肛拭子更靠谱。如果在隔离前已经感染病毒，那么这时候应该有IgM阳性结果。常听到这样的感叹：新冠病毒太狡猾！面对着狡猾的病毒，如果我们不能多动脑子，那底裤真会被输掉。
参考文献：
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3.汪小五, 朱义朗, 李团团, 高勇. 新型冠状病毒肺炎患者恢复期肛拭子中 SARS-CoV-2 核酸检测结果评价. 天津医药. 2020;48(7):592.4.Washington NL, White S, Barrett KMS, Cirulli ET, Bolze A, Lu JT. S gene dropout patterns in SARS-CoV-2 tests suggest spread of the H69del/V70del mutation in the US. medRxiv. 2020:2020.12.24.2024881
4. doi: 10.1101/2020.12.24.20248814.
5.Qi，Shunxiang, Zhao X, Hao P, Liu N, Gao GF, Song Y, Xu W, Li Q. Two Reemergent Cases of COVID-19 — Hebei Province, China, January 2, 2021. China CDC Wkly. 2021.
6. SARS-CoV-2 Variant – United Kingdom of Great Britain and Northern Ireland, Disease Outbreak News, 21 December 2020, https://www.who.int/csr/don/21-december-2020-sars-cov2-variant-united-kingdom/en/.
7. Genetic Variants of SARS-CoV-2 May Lead to False Negative Results with Molecular Tests for Detection of SARS-CoV-2 - Letter to Clinical Laboratory Staff and Health Care Providers. https://www.fda.gov/medical-devices/letters-health-care-providers/genetic-variants-sars-cov-2-may-lead-false-negative-results-molecular-tests-detection-sars-cov-2.